Kromatografi dan Macam-Macamnya

A. Pengertian Kromatografi

Kromatografi adalah pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kecepatan zat terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan benda penyerap. Setiap zat kimia mempunyai kecepatan yang berbeda pada pelarut tertentu. Hal ini disebabkan adanya perbedaan kelarutan setiap jenis zat yang akan dipisahkan. Kromatografi dapat digunakan untuk memisahkan zat-zat penyusun yang terdapat dalam suatu campuran. Pada pemisahan menggunakan metode kromatografi, campuran larutan dilewatkan pada permukaan zat yang tidak reaktif/tidak mudah bereaksi secara kimia (zat inert), seperti silika, alumina, atau kertas khusus. Zat inert adalah fase diam karena zat tidak ikut bergerak bersama campuran. Selain fase diam, terdapat juga fase bergerak. Fase bergerak dapat berupa gas atau cairan. Disebut fase bergerak karena cairan atau gas tersebut akan bergerak bersama-sama campuran melewati permukaan zat inert (fase diam).

Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik. Tujuan kromatografi preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran (biasanya digunakan untuk pemurnian). Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui perbandingan senyawa dalam campuran.

Kromatografi adalah teknologi untuk memisahkan sebuah campuran menjadi komponen-komponen penyusunnya. Teknologi ini melibatkan dua bagian penting yaitu bagian yang bergerak dan bagian yang diam. Bagian yang bergerak dimaksudkan kepada sampel campuran yang akan dipisahkan menjadi komponen penyusunnya, sedangkan bagian yang diam ditujukan kepada suatu bahan yang digunakan untuk memisahkan campuran. Bagian yang bergerak dalam bahasa Inggris biasa disebut dengan mobile phase, sedangkan bagian yang diam biasa disebut dengan stationery phase.

Munculnya istilah “bagian yang bergerak” dan “bagian yang diam” adalah berdasarkan atas proses kerja kromatografi. Dimana sampel sebuah campuran yang biasanya telah larut di dalam zat pelarut, dilewatkan ke dalam sebuah material khusus yang diam sehingga proses pemisahan campuran dapat terjadi. Sampel campuran akan terpisah menjadi komponen-komponennya berdasarkan perbedaan relatif kemampuan komponen-penyusun-campuran untuk terikat dengan zat lain. Sebagai satu contoh agar kita lebih memahami prinsip dasar kromatografi, mari kita perhatikan gambar di bawah ini.

Prinsip Dasar Kromatografi
(Sumber)

Gambar di atas adalah sebuah proses pemisahan petroleum eter, atau lebih kita kenal sebagai bensin, menjadi beberapa komponen zat yang memiliki perbedaan warna. Proses ini diperkenalkan oleh seorang ahli botani bernama Mikhail Tsvet pada tahun 1901 sebagai pencetus teknologi kromatografi. Pada percobaan ini ia menggunakan petroleum eter sebagai “bagian yang bergerak”, dan mengalirkannya ke dalam sebuah kolom kaca bening berisi bubuk kalsium karbonat yang berfungsi sebagai “bagian yang diam”.

Hasil percobaan di atas adalah terpisahnya petroleum eter ke dalam beberapa warna pigmen tumbuhan yakni hijau (klorofil), kuning (xanthophyll), dan oranye (karoten). Seperti yang nampak pada ilustrasi di atas, ketiga zat penyusun tersebut terpisah dan berada pada tingkat elevasi yang berbeda pada kolom kalsium karbonat. Hal ini terjadi karena ketiga pigmen tersebut memiliki nilai afinitasyang berbeda antar ketiganya.

Afinitas adalah derajat kemampuan sebuah atom atau molekul untuk terikat secara kimia dengan atom atau molekul lainnya. Semakin besar nilai afinitas suatu zat, maka semakin mudah ia untuk terikat dengan zat lain. Pada percobaan kromatografi di atas nilai afinitas dari ketiga pigmen tersebut dari yang tertinggi hingga yang terendah berturut-turut adalah klorofil, xanthophyll, dan karoten. Sehingga nampak bahwa sesaat setelah petroleum eter dimasukkan ke dalam kolom kalsium karbonat, yang bereaksi lebih dulu dan menghasilkan warna hijau adalah pigmen klorofil (paling atas). Disusul dengan xanthophyll yang bereaksi dengan kalsium karbonat membutuhkan waktu yang lebih lama, dan pigmen karoten yang membutuhkan waktu paling lama untuk bereaksi dengan kalsium karbonat sehingga menimbulkan warna oranye pada sisi bawah kolom.

Percobaan Kromatografi Pada Laboratorium
(Sumber)

Penggunaan kromatografi dikelompokan menjadi dua tipe yakni untuk kebutuhan laboratorium dan untuk kebutuhan produksi. Pada laboratorium, kromatografi digunakan pada sebuah campuran atau larutan kimia untuk mengetahui zat-zat penyusun campuran tersebut. Sedangkan untuk kebutuhan produksi, prinsip kromatografi digunakan untuk produksi masal suatu zat. Salah satu contoh adalah proses demineralisasi air yang menggunakan prinsip kromatografi pertukaran ion untuk mengikat mineral-mineral di dalam air. Air hasil proses demineralisasi biasa digunakan untuk bahan baku pembangkit listrik tenaga uap sebagai media kerja siklus air-uap air.

B. Istilah dalam Kromatografi

Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah sebagai berikut:

• Analit adalah zat yang dipisahkan. 
• Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak karakteristik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
• Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
• Fase gerak adalah fase zat yang bergerak pada arah tertentu.
• Fase diam adalah fase yang tetap pada tempatnya.
• Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
• Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen analit.  

 C. Macam-Macam Kromatografi

1. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.

KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter et al, 1991).

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.

  a. Pelaksanaan KLT

     1.   Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap  berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi (Gandjar & Rohman, 2007).

      2.    Fase Gerak

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :

     1.      Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.

   2.    Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

    3.      Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007).

  b. Deteksi Bercak

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:

1.      Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel akan berpendar.

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika disinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan,, kita harus menandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan  pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Karena jika  kita  mematikan sinar UV tersebut, bercak-bercaknya tidak tampak kembali.

2.      Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

c. Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Kromatografi Lapis Tipis

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga R_f  adalah :

      1.      Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

      2.      Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan menge­ringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga  R_f meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,   jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap  dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.

      3.      Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

      4.      Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

      5.      Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

      6.      Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).

      7.      Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terben­tuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga R_f.

      8.      Suhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.

      9.      Kesetimbangan.

Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih pen­ting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan at­mosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah.

2. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas merupakan kromatografi cairan - cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Teknik ini sangat sederhana. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut. 

Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka. 

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut. 

       A. Jenis Kromatografi Kertas

       Kromatografi kertas ada dua jenis yaitu : 

       1)        Kromatografi kertas satu arah

Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Sampel tinta diteteskan pada garis dasar pinsil pada selembar kromatografi kertas. Beberapa pewarna larut dalam jumlah yang minimum dalam pelarut yang sesuai, dan itu juga di teteskan pada garis yang sama.

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis pada bercak diatasnya. Kadang-kadang kertas hanya digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan posisi berdiri pada bawah wadah. Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.  

 
2)        Kromatografi kertas dua arah

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa. Waktu ini kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang ditempatkan ke depan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan dalam sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian atas kertas.

Sangat menarik untuk mencoba menjelaskan kromatografi kertas dalam kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang berbeda pada permukaan kertas. Dengan kata lain, akan baik menggunakan beberapa penjelasan untuk kromatografi lapis tipis dan kertas. Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air dari atmosfer sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Kertas sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang sangat tipis dari molekul-molekul air yang berikatan pada permukaan.Interaksi ini dengan air merupakan efek yang sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.

 

3. Kromatografi Pertukaran Ion

Kromatografi Pertukaran ion adalah proses pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran atau proses substitusi satu jenis senyawa ionik dengan yang lain terjadi pada permukaan fase stasioner. Fase stasioner tersebut merupakan suatu matriks yang kuat (rigid), yang permukaannya mempunyai muatan, dapat berupa muatan positif maupun negatif. Mekanisme pemisahan berdasarkan pada daya tarik elektrostatik.

Bila matriks padat trsebut mempunyai gugus fungsional yang bermuatan negatif seperti gugus sulfonat (-SO₃^-), maka akan dapat berfungsi sebagai penukar kation. Sebaliknya, bila bermuatan positif, misalnya mempunyai gugus amin kuaterner (-N(CH)₃⁺), maka akan dapat berfungsi sebagai penukar anion. Kromatografi ini sangat bermanfaat untuk memisahkan molekul – molekul bermuatan terutama ion – ion baik anion maupun kation. Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun 1850. Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu:

• ·         Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus karboksil (-CH2-CH2-CH2SO3- dan -O-CH2COO-). Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah asam sitrat, asam laktat, asam asetat, asam malonat, buffer MES dan fosfat.

• ·        K romatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan –N+(CH3)3. Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin.

Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama enzim). Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara lain senyawa alkohol, alkaloid, asam amino, dan nikotin.

Kromatografi penukar ion dilakukan dengan fasa diam yang mempunyai gugus fungsi bermuatan. Kebanyakan mekanisme penukaran ion sederhana:

(a) X^- + R⁺Y^-Y^- + R⁺X^- (penukar anion)

Dimana X adalah ion cuplikan

Y adalah ion fasa gerak

R adalah bagian Inc. Pada resina

Pada kromatografi penukar anion ion cuplikan X^- bersaing dengan ion fasa gerak Y^-, terhadap bagian ionik pada penukar ion R. Pemisahan ion sederhana berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan resina. Jika senyawa terlarut berinteraksi lemah dengan adanya ion fasa gerak, ion terlarut keluar awal pada kromatogram, sedangkan senyawa terlarut yang berinteraksi kuat dengan resina, berarti lebih kuat terikat dan keluar belakangan.

      a. Fase Diam dan Fase Gerak

    1. Fase Diam

Ada banyak macam penukar ion, tetapi penukar ion polisterina berikatan silang paling luas penggunaannya.Gambar 65. b menggambarkan struktur resina penukar anion dengan matriks poliestirena berikatan silang yang sama, tetapi dengan gugus tetraalkilamonium. Resina poliestirena kerng cenderng mengembang jika dimasukkan dalam pelarut. Air menetrasi ke dalam resina dan hidrasi, membentuk larutan sangat pekat dalam resina. Tekanan osmosa cenderung menekan air lebih banyak ke dalam resina dan padatan itu mengembang, jadi volumenya bertambah. Jumlah air yang diambil resina tergantung pada ion penukar dari resina dan menurun dengan bertambahnya jumlah ikatan silang. Resina penukaran ion juga mengembang dalam pelarut organik, tetapi pengembangannya lebih kecil daripada dalam air. 

2. Fase Gerak

Kebanyakan pemisahan kromatografi penukar ion dilakukan dalam media air sebab sifat ionisasi dari air. Dalam beberapa hal, digunakan pelarut campuran seperti air, alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak media air, reteni puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik dan oleh pH fasa gerak. Kenaikkan kadar garam dalam fasa gerak menurunkan retensi senyawa cuplikan. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion cuplikan bersaing dengan ion fasa gerak untuk gugus penukar ion pada resina.

Macam ion dalam fase gerak dapat berpengaruh nyata pada retensi molekul cuplikan, sebagai akibat dari perbedaan kemampuan ion fasa gerak berinteraksi dengan resina penukar ion. Urutan retensi dari berbagai aniom untuk resina penukar anion poliestirena berikatan silang konvensional adalah sebagai berikut;

Sitrat > sulfat > oksalat > yodida > nitrat > kromat >bromida >sianida > klorida > format > asetat > hidroksida > fluorida.

Untuk retensi ini bervariasi jika resina yang digunakan berbeda, tetapi urutan di atas merupakan petunjuk kualitatif dari kemampuan berbagai anion untuk berinteraksi dengan penukar anion kuat. Dalam urutan ini, sitrat terikat sangat kuat dengan resina sedangkan ion fluorida terikat paling rendah. Molekul cuplikan biasanya lebih cepat terelusi dengan ion sitrat daripada dengan fluorida.

Pemisahan senyawa-senyawa organik seperti asam-asam amino pun telah dapat dicapai dengan metode penukar ion. Metode ini juga digunakan dalam berbagai operasi seperti pelunakan air, menaikkan kadar logam, pemisahan logam. Pada awalnya penukar ion adalah silikat-silikat, tanah diatonema, aluminosilikat sintetis seperti zeolit. Penemuan ini adalah suatu kebetulan. 

b. Penggunaan kromatografi penukar ion

1. Untuk menghilangkan ion

Untuk menghilangkan ion-ion keseluruhannya, air tersebut dapat dialirkan melalui penukar kation, kemudian dialirkan melalui penukar anion, yang akan menghilangkan semua anion dan diganti dengan ion hidroksida. Bila kedua resin tersebut (kation dan anion) dijadikan satu, penghilangan kedua jenis ion tersebut sekaligus dapat dikerjakan.

2. Mengkonsentrasikan komponen berkadar kecil

Ion-ion yang jumlahnya kecil (trace element) dapat dikonsentrasikan dengan penukar ion. Setelah ion solut terikat dalam kolom, kemudian dielusi dengan jumlah eluen yang kecil.

3. Pemisahan asam-asam amino

Pada suatu pH, Asam-asam amino dapat dipisahkan menjadi tiga golongan berdasarkan titik isoelektrisnya. Dengan demikian campuran asam-asam amino dapat dipisahkan dalam suatu aliran fase mobil dengan secara gradual dengan merubah pH untuk elusi (gradient elution). Perubahan pH sering dikombinasikan dengan perubahan suhu.

                                         

4. Kromatografi elektroforesis 

Kromatografi elektroforesis menyangkut perbedaan migrasi spesies-spesies bermuatan dalam suatu larutan di bawah pengaruh dari penggunaan suatu gradient potensial. Kecepatan migrasi setiap spesies tergantung atas ukuran, bentuk dan muatan spesiesnya. Metoda elektroforesis merupakan metoda pemisahan suatu  zat berdasarkan perbedaan muatan dan massa melekul relative dari komponen-komponennya.  Pemisahan terjadi karena perbedaan laju migrasi komponen-komponen bermuatan oleh pengaruh medan listrik.

          5. Kromatografi Gas 

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).

Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.

Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.

Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.

Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.

6.  Kromatografi Penyaringan Gel  

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.